MAKALAH SEMINAR LITERATUR JHD (3)

PROSEDUR PERCOBAAN

Persiapan Teh Cair
Tumbuhan yang sudah dikering-anginkan diinfusikan ke dalam aquadest, dididihkan selam lebuh kurang 30 menit. Setelah itu dilakukan penyaringan dengan menggunakan kertas saring Whatman no. 4. Penyaringan menggunakan vacuum agar diperoleh konsentrat sebagai residunya. Residu yang diperoleh dilarutkan kembali ke dalam aquades hingga mencapai konsentrasi 60 g/L. Larutan yang diperoleh dari proses ini disebut sebagi sampel teh cair yang selanjutnya akan diuji.

Penentuan Kandungan Polifenol
Penentuan kandungan polifenol dilakukan berdasarkan metoda Folin Ciocalteau. Metoda ini menggunakan reagen folin yang sering digunakan untuk menganalisis senyawa-senyawa seperti flavonoid, katekin, antocianin dan sebagainya.

Analisis HPLC-PDA
Analisis ini menggunakan kolom yaitu Pinnacle II C-18 (250 × 4.6 mm i.d., 5 mm) termasuk Pinnacle C-18 guard (10×4mm i.d., 5 mm). Detektor yang digunakan adalah detector PDA (Photo Diode Array). Pelarut yang digunakan adalah methanol, aquades, dan asam asetat dengan perbandingan pelarut (metanol : aquades : asam asetat) adalah sebagai berikut :
- Pelarut A (10 : 88 : 2)
- Pelarut B (90 : 8 : 2)
- PelarutC (100 : 0 : 0)

Penentuan Aktivitas Antioksidan :

BCB Method (β-Carotene Bleaching Methode) atau Metoda Pemutihan β-karoten

β-Carotene ditambahkan Linoleic Acid dan Tween 40. dilarutkan ke dalam CHCl3 (kloroform), dievaporasikan dengan menggunakan rotary evaporator. Hasilnya ditambahkan dengan aquades teroksigenasi. Proses selanjutnya adalah mengemulsikan campuran tersebut selama 1 jam menggunkan ultrasonic bath. Pada akhir proses ini akan diperoleh emulsi.

Analisis dilakukan berdasarkan metoda spektrofotometri pada panjang gelombang 470 nm. Emulsi dipisahkan menjadi 2 bagian, satu bagian sebagai blanko dan bagian yang lainnya akan ditambahkan dengan sampel teh cair. Perlakuan yang sama untukmasing-masing sampel yaitu sampel teh cair Oregano, Thyme dan Wild Thyme. Setelah dilakukan pengukuran absorban maka digunakan rumus sebagai berikut :

AAC=[(AA(120)–AC(120))/(AC(0)–AC(120)] x 1000

Dimana, AAC adalah Antioxidant Activity Coefficient (koefisien aktifitas antioksidan), AA(120) adalah absorban emulsi + antioksidan pada waktu t = 120 menit, AC(120) adalah absorban blanko pada waktu t = 120 menit, AC(0) adalah absorban blanko pada waktu t = 0 menit.

DPPH (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazil) Radical Scavenging Method (Metoda penangkapan Radikal DPPH)

Metoda selanjutnya menggunakan sistem emulsi sedangkan pada metoda ini digunakan metoda penghambatan radikal DPPH oleh antioksidan. Pengukuran dilakukan berdasarkan metoda spektrofotometri pada panjang gelombang 517 nm. Seperti biasa pada metoda spektrofotometri, bagian pertama adalah blanko yang akan diukur berupa senyawa DPPH di dalam etanol sementara bagian kedua adalah DPPH/etanol yang ditambahkan dengan sampel. Aktivitas antioksidan pada metoda ini dinyatakan sebagai persen inhibisi antioksidan. Perhitungannya dengan cara memasukkan nilai absorban yang diperoleh ke dalam rumus di bawah ini :

Inhibition / % = (AC(0)–AA(t)/(AC(0)) x 100

Dimana, AC(0) adalah absorban blanko pada t = 0 menit, AA(t) adalah absorban sampel antioxidant pada t = 1 jam

Thiobarbituric Acid Reactive Species Assay (TBARS Assay)

Homogenate kuning telur ditambahkan dengan sampel antioksidan (masing-masing sampel). Kemudian ditambahkan aquades. Selanjutnya ditambahkan larutan 2,2’-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride dalam air. Lalu ditambahkan asam asetat di dalam sodim dedosil sulfat (SDS). Campuran yang diperoleh akan dipanaskan pada suhu 950 C selama 1 jam, kemudian didinginkan dan ditambah dengan Butanol. Campuran ini akan disentrifus pada 1200 x g selam 10 menit hingga diperoleh lapisan organik pada bagian atasnya. Lapisan ini selanjutnya akan diukur berdasarkan metoda spektrofotometri pada panjang gelombang 532. Aktivitas antioksidannya akan dihitung berdasarkan absorban yang diperoleh menggunakan formula di bawah ini :

AI / % = (1–AT/AC) x 100

Dimana, AC adalah absorban blanko sedangkan AT adalah absorban sampel antioksidan.

Induction Period of Lard Oxidation assay (Rancimat Assay)

Metoda ini menggunakan lemak babi yang akan diinduksi menggunakan peralatan Rancimat model 743. Lemak babi tanpa penambahan sampel digunakan sebagai blanko. Aktivitas antioksidan akan ditentukan berdasarkan lamanya waktu induksi (Induction Time) dengan rumus sebagai berikut menghitung nilai AI. Nilai AI adalah waktu induksi lemak babi (banko) dibagi dengan waktu induksi sampel antioksidan yang ditambahkan lemak babi.